ELISA定量方法的類型和構(gòu)架

ELISA定量方法的類型和構(gòu)架從事生物藥研發(fā)的你，不可不知的ELISA開發(fā)方法|干貨滿滿！快來看看ELISA在生物藥研發(fā)中的直接法實(shí)驗(yàn)方案吧！

ELISA定量方法的類型和構(gòu)架前言

ELISA在生物**研發(fā)的各個(gè)環(huán)節(jié)均有廣泛的應(yīng)用：

如以生物大分子檢測(cè)為目的，在藥效藥代評(píng)估時(shí)，對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)中的血液樣品的**濃度和生物大分子標(biāo)志物進(jìn)行定量檢測(cè)；

以親和力測(cè)定為目的，在質(zhì)量分析過程中，對(duì)抗體相對(duì)于靶點(diǎn)抗原的親和力檢測(cè)；

以親和力篩選為目的，在抗體發(fā)現(xiàn)過程中，對(duì)雜交瘤細(xì)胞克隆上清分泌抗體相對(duì)于靶點(diǎn)抗原的親和力大小進(jìn)行區(qū)分等。

使用目的不同，則需要選取不同特性試劑耗材。

參差多態(tài)方顯世界精彩，ELISA方法學(xué)開發(fā)也是一個(gè)道理。

本篇為ELISA方法開發(fā)構(gòu)建的的幾大實(shí)例之一——生物大分子檢測(cè)的定量方法開發(fā)的具體實(shí)驗(yàn)方案，適用于所有初接觸ELISA方法技術(shù)且有志于進(jìn)行ELISA方法開發(fā)建立的同仁。

ELISA定量方法的類型和構(gòu)架

采用ELISA技術(shù)進(jìn)行定量的平臺(tái)化方法——一般來說可以分為兩類，即間接法和直接法。

間接法也稱為競(jìng)爭(zhēng)法，直接法也稱雙抗夾心法。

今天，我們重點(diǎn)為大家介紹直接法。

直接法以定量抗原為例：

首先，以與抗原有強(qiáng)親和力的抗體包被固定在酶標(biāo)板材上，加入抗原標(biāo)準(zhǔn)品/樣品反應(yīng)，再加入與抗原有強(qiáng)親和力的抗體并且偶聯(lián)了辣根過氧化氫酶HRP/堿性磷酸酶AP的酶聯(lián)抗體反應(yīng)，*后加入酶對(duì)應(yīng)的底物顯色，中間通過洗滌去除反應(yīng)體系中未結(jié)上的試劑成分。

這樣信號(hào)大小和抗原的濃度成正相關(guān)，隨著反應(yīng)的進(jìn)行酶標(biāo)板材上固定的成分由抗體，轉(zhuǎn)變?yōu)榭贵w-抗原，*后變?yōu)榭贵w-抗原-酶聯(lián)抗體，待測(cè)的抗原處于兩個(gè)抗體之間，所以也稱為雙抗夾心法。

雙抗夾心法有一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：待檢測(cè)的物質(zhì)（如抗原）必須給包被抗體和酶聯(lián)抗體提供兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，這兩個(gè)位點(diǎn)可以是抗原上兩個(gè)以上相同的結(jié)構(gòu)位點(diǎn)，也可以是不同的結(jié)構(gòu)位點(diǎn)。

一般來說，Elisa的構(gòu)架由標(biāo)準(zhǔn)品，內(nèi)控品，空白對(duì)照，基質(zhì)對(duì)照和待測(cè)樣品組成。

標(biāo)準(zhǔn)品
根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體應(yīng)用方向來源，標(biāo)準(zhǔn)品可以是已知濃度的國(guó)際/國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品或者商業(yè)化的已知濃度的蛋白分子，也可以是自制的以其他方式定量（如紫外吸收定量）的純度較高的蛋白分子。標(biāo)準(zhǔn)品一般為7-8個(gè)濃度點(diǎn)，擬合成合適的濃度-信號(hào)劑量曲線作為標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行內(nèi)控品和樣品的定量。

內(nèi)控品
其中，內(nèi)控品是能夠長(zhǎng)期使用的、獨(dú)立分裝的、特定濃度（高中低）的標(biāo)準(zhǔn)品，是監(jiān)控ELISA實(shí)驗(yàn)在單次實(shí)驗(yàn)中的質(zhì)量和長(zhǎng)期的應(yīng)用過程中不同批次標(biāo)準(zhǔn)品的過渡橋接。

空白對(duì)照
空白對(duì)照為不含標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，基質(zhì)對(duì)照則為不含樣品的樣品溶液——兩者可能是一樣的成分，也可能是不同的成分，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體情況進(jìn)行區(qū)分，目的是確認(rèn)ELISA體系中是否有非特異的交叉反應(yīng)。
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